Передовые технологии в клинической лабораторной диагностике

В настоящее время значительно улучшилось лечение больных терминальной почечной недостаточностью (ТПН) с помощью хронического гемодиализа. Выделяются значительные средства, открываются новые центры и отделения гемодиализа (ОГ). Не все из них имеют возможность в своем составе иметь полноценную клинико-диагностическую лабораторию (КДЛ). В нашем центре гемодиализа, обслуживающем около 80 больных с ТПН, ожидающих почечную трансплантацию или перенесших ее, накоплен успешный 20 летний опыт существования такой лаборатории непосредственно в рамках клинического подразделения. Методическая база работы в нашей лаборатории создавалась с учетом литературных данных и на основании собственного опыта. Поскольку данный опыт характерен для учреждения, являющего ведущим научно-практическим центром в своей области, то в силу ряда причин он не может быть полностью перенесен на работу небольших и региональных ОГ. Поэтому целью настоящей работы было изучение возможностей по применению новейших разработок в области клинической лабораторной диагностики, имеющих обобщенное название «анализ по месту лечения», в таких отделениях, где невозможно создание полноценной собственной лаборатории, а работа с централизованными крупными КДЛ затруднена по различным причинам.

Биохимический автоматический экспресс-анализатор Пикколо (АБАКСИС, США) является фотометрическим прибором, отвечающим принципу «анализ по месту лечения». В отличие от обычных биохимических анализаторов, анализы в нем осуществляются на одноразовом пластиковом «реакционном диске». Путем сложного программируемого режима вращения этого диска осуществляются все операции по анализу: от отделения форменных элементов крови, дозирования плазмы, разведения, создание рабочей смеси реагентов из сухих лиофилизатов, до проведения тест - реакции при 37 оС в кинетическом режиме или режиме «конечной точки» с измерением параметров на 9 длинах волн. Встроенная автоматическая система контроля качества Пикколо производит более 100 контрольных измерений на образец. Анализ одной пробы занимает 15 минут. Всего в настоящее время имеется одиннадцать вариантов реагентных панелей, соответствующих наиболее распространенным профилям биохимических анализов.

Задачей данной работы было сравнение результатов анализов выполненных на анализаторе Пикколо с результатами, полученными в нашей лаборатории для тех же пациентов. Следует отметить, что лабораторная диагностика у больных ТПН имеет свои особенности как по выбору параметров для клинического обследования больных, так и по методическим аспектам по выполнению теста. Набор тестов обследования больных на гемодиализе отличается от принятых в клинической практике профилей и включает в себя следующий набор параметров: 1) метаболиты - мочевину и креатинин (для оценки качества лечения), 2) общий белок и альбумин (для оценки общего физического статуса больного и избытка воды), 3) электролиты - натрий, калий, хлор и КЩС (для оценки качества лечения), 4) параметры кальций-фосфорного обмена - Са++, общий кальций, фосфор, магний, щелочная фосфатаза (для контроля и коррекции терапии специфической патологии костей у больных на гемодиализе), 5) другие биохимические параметры (у этой категории больных исследуются с меньшей частотой или при подозрении на соответствующую патологию — например, гепатит или атеросклероз).

Следует также обратить внимание на то, что у больных с ТПН, находящихся на гемодиализе, часть параметров биохимического исследования имеют результаты на порядок (креатинин) или в несколько раз (мочевина, ЩФ) выше физиологической нормы. Уремическая плазма и сыворотка из-за присутствия в ней спектра низко- и среднемолекулярных соединений и измененного анионного состава существенно изменяет кинетику многих лабораторных тестов, что влияет на получаемые результаты. При определении АСТ и АЛТ у этой категории больных отмечается снижение значений на 10-90 %, для ГГТ — увеличение на 20 %, для амилазы — увеличение на 50 %, для креатинкиназы — увеличение на 10-50 %, для ЛДГ — увеличение на 35 %.

Материалы и методы:

Исследования были проведены на группе из 10 пациентов центра гемодиализа, получающих адекватное лечение три раза в неделю по 4-5 часов в условиях стандартного режима. Кровь отбирали перед очередной процедурой после двухдневного междиализного промежутка. Материалом исследования служила гепаринизированная плазма крови. Измерения на анализаторе Пикколо проводили в одной и той же пробе плазмы одновременно с биохимическими тестами, принятыми в нашей лаборатории. Были использованы реактивы фирмы «ДИАСИС» (Германия), полуавтоматические анализаторы ЭПОЛЛ-20 («ЭКО-МЕД-ПОЛЛ», Австрия) и BTS-330 («Био Системс», Испания), а также анализаторы Ionometer 2 (Na, K, Ca) («Фрезениус», Германия) и КЩС - ABL-77 («Радиометер», Дания). В качестве реакционного диска для анализатора Пикколо использовали «объемную метаболическую панель». Она в целом соответствует необходимым тестам для гемодиализных пациентов.

Сравнение клинико-биохимических методов, использованных в качестве тестов в лаборатории центра гемодиализа (ЛЦГ) и в «объемной метаболической панели» Пикколо приведены в таблице №1. В нашей лаборатории с учетом специфики проведения анализов у пациентов на гемодиализе были применены некоторые модификации методов для улучшения качества получаемых результатов. Так, общепринятый сейчас короткий кинетический вариант реакции Jaffe не дает линейности на всем необходимом нам диапазоне значений и при значениях выше 0,8 ммоль/л может давать завышенный результат, а при значениях выше 1,4 ммоль/л - наоборот заниженный. Поэтому в нашей лаборатории мы используем метод с депротеинизацией, причем не с ТХУ, а более мягкий - с вольфраматом натрия и разведением образца плазмы в соотношении 1:8. Он показал более удовлетворительную линейность в диапазоне от 0,03 до 2,5 ммоль/л. Для креатинина и мочевины используем определение калибровочного фактора по 2 точкам с существенно более высокими значениями, чем принято. Так же мы провели модификацию кинетических тестов для ферментов АЛТ, АСТ, ЩФ. Расчет скорости реакции мы проводим по 10 точкам с 30 секундным интервалом и удлиненной ЛАГ-фазой до 30 секунд.

Мы проанализировали информацию фирмы — изготовителя Пикколо по характеру используемых методов. Как видно из таблицы №1, практически во всех методах компания АБАКСИС использовала новейшие разработки в области клинической химии (хлориды, креатинин, билирубин, общая двуокись углерода) или модификации, существенно улучшающие качество измерения. Например, фотометрия с использованием двух или трех длин волн.

Результаты и обсуждение

А. Сравнение результатов измерения контрольной сыворотки TruLab P («Диасис», Германия)

В сравнении не оценивали три параметра: общую двуокись углерода - так как сыворотка была предварительно заморожена, натрий и калий — так как данных по ним не было в референтной таблице данного лота сыворотки. Исследования контрольной сыворотки представлены в таблице №2. Даже при единичном исследовании обнаруживается очень хорошая сходимость результатов по контрольной сыворотке между Пикколо и нашими тестами. Для таких тестов как креатинин, мочевина, кальций, альбумин отличия составляли менее 2 %, для общего белка, хлоридов, билирубина — менее 10 %, для АСТ, АЛТ, глюкозы - 10 —12 %. Все результаты тестов, кроме ЩФ, также удовлетворительно соответствовали референтному интервалу сыворотки для соответствующих параметров. Для некоторых новых модификаций методов, использованных в Пикколо, референтные интервалы фирмой «ДиаСис» предусмотрены не были.

Особо следует отметить данные по определению активности ЩФ. Результат на Пикколо получился почти в 2 раза ниже, чем было указано в контрольной сыворотке и получилось у нас. Однако, АБАКСИС так же задает и соответственно более низкий диапазон нормальных значений для этого типа анализа — 42 — 141 Ед/л против 60 — 304 Ед/л для стандартных вариантов этого теста по DGKC или IFCC.

В то же время обращает на себя внимание значительно увеличенный диапазон линейности для теста ЩФ на Пикколо — от 5 до 2400 Ед/л. В приборе был использован модифицированный метод AACC и IFCC с использованием гидролиза p-нитрофенил фосфата. Развитием метода при этом явилось использование металл-ионного буфера с цинком и магнием для поддержания их концентрации во время протекания биохимической реакции, а также измерение на двух длинах волн — 405 и 500 нм.

Б. Сравнение результатов измерения у больных с ТПН на программном гемодиализе.

Проводя данное исследование, мы объективно понимали, что 10 измерений не достаточно для полноценного статистического исследования. Но нам было важно в первую очередь оценить принципиальную возможность использования прибора Пикколо в достаточно сложной клинической ситуации для особой категории больных. Сравнительное исследование результатов измерения у больных с ТПН на программном гемодиализе представлены в таблице №3.

Полученные результаты показали три варианта сходимости результатов тестов между анализатором Пикколо и обычным их выполнением. При определении альбумина, общего белка, креатинина, натрия, общего билирубина, общей двуокиси углерода не было выявлено достоверных различий в результатах. Причем для альбумина, общего белка и креатинина была продемонстрирована очень хорошая сходимость результатов как в отдельных пробах, так и в аналогичных измерениях в контрольной сыворотке. Особенно важным была демонстрация отличной работы теста на креатинин у анализатора Пикколо, который оказался полностью адекватен сложному в выполнении референтному методу с осаждением белка. Так же определения натрия на анализаторе Пикколо оказалось сравнимым с более точным ионоселективным методом определения электролитов.

Измерения АЛТ, глюкозы, калия были выше при измерении с помощью Пикколо, а общего кальция и хлоридов ниже, чем при обычном выполнении этих тестов. Но различия не были достоверны. Для всех этих тестов различия были однонаправленными, стабильными и поэтому могут прогнозироваться в дальнейшей работе.

Достоверное повышение результатов на Пикколо было определено для мочевины и АЛТ. Существенное понижение результатов было продемонстрировано для ЩФ. Эти тесты требуют более подробного анализа результатов.

В. Оценка результатов по определению активности ЩФ.

Как указывалось выше, в результате усовершенствования теста на Пикколо удалось достичь значительного увеличения линейного диапазона измерений. Это привело к снижению диапазона средних значений и норм для данного метода. Полученные результаты для больных, так же как и для контрольной сыворотки оказались существенно ниже, чем в обычном измерении. С помощью подсчета коэффициента различий было установлено, что имеется пропорциональное снижение результатов по активности ЩФ у Пикколо по сравнению с общепринятыми тестами. При этом линейный диапазон измерений, позволяющий при высокой активности фермента ЩФ использовать неразведеный материал, увеличен в 2,5 раза. Следовательно использованный метод дает большие возможности для мониторинга гиперпаратиреоза у больных ТПН на гемодиализе, когда часто имеется значительное повышение уровня активности ЩФ.

Г. Оценка результатов по определению концентрации мочевины.

При определении концентрации мочевины результаты для Пикколо были в среднем выше за исключением одного больного. Исследования у двух больных показали существенные расхождения результатов (более 10 ммоль/л) и определили плохую сходимость средних результатов. Из нашего опыта использования уреазной реакции мы знаем, что у некоторых больных это возможно из-за определенных факторов, влияющих на кинетику реакции в самом ее начале. С учетом клинического состояния этих двух больных и тактику их лечения, действительно можно считать цифры выше 40 ммоль/л у них ошибкой измерения. Но этот вопрос требует серьезного методического исследования, которое невозможно в рамках данной работы.

Д. Оценка результатов по определению активности АСТ.

В целом отмечалось более высокое значение активности фермента, определяемое на Пикколо, хотя это не было отмечено для контрольной сыворотки. Но так же, как и для ЩФ, компания АБАКСИС указывает более высокие значения среднестатистической нормы — 10 — 47 Ед/л против 5- 40 Ед/л в немодифицированных тестах, а также более широкий линейный диапазон — до 2000 Ед/л. Поэтому полученные различия являются свойством используемой в Пикколо модификации просто должны учитываться при интерпретации результатов. Важно, что в этом случае не наблюдается тенденции к заниженным результатам, которая встречается при измерениях на других автоматических анализаторах у данной категории больных.

Заключение

Проведенная работа выявила принципиальную возможность использования анализатора Пикколо в отделениях гемодиализа для мониторинга за состоянием больных. Такие важные показатели, как электролиты, креатинин, белковый обмен, кальций — фосфорный обмен, показатели функции печени измеряются с высокой точностью результатов. Примечательно, что использование в Пикколо современных улучшенных биохимических методов позволяет даже при серьезных метаболических сдвигах в течение 15 минут точно определять концентрацию аналитов. Очевидно, биохимический экспресс — анализатор Пикколо можно рекомендовать для небольших отделений гемодиализа, в которых отсутствует полноценное лабораторное отделение, а также для медицинских центров, заинтересованных в высоком качестве лабораторных исследований.

Таблица N1. Сравнение используемых биохимических методов

Таблица N3. Сравнение результатов измерения у больных с ТПН на программном гемодиализе